ChIP實驗Tips匯總（上），來自英國ChIP實驗專家Chromatrap?的分享

ChIP是一種發(fā)展很快的研究技術(shù)，主要應(yīng)用于確定細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，這一點對正確的基因調(diào)控尤為重要。ChIP在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域正被逐漸應(yīng)用于藥物研發(fā)中的分子機(jī)制研究、分層醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)以及將ChIP與第二代測序相結(jié)合的ChIP-seq技術(shù)中。

當(dāng)您在為遇到上述的問題食不知味、夜不能寐、山重水復(fù)疑無路時，不妨看看英國ChIP實驗專家Chromatrap?提供的Top 10 tips錦囊，或許能柳暗花明又一村！

一個成功的ChIP實驗很大程度上依賴于所制備的染色質(zhì)的質(zhì)量。染色質(zhì)制備 重要的三個方面包括：裂解、交聯(lián)、片段化。每一個步驟都應(yīng)該被獨立地優(yōu)化以合適地還原所研究的生物過程。請閱讀以下在染色質(zhì)制備中的相關(guān)技巧。

染色質(zhì)在室溫保存或處理時極易被降解，且速度非常快。為了防止染色質(zhì)的快速降解以及獲得具有良好可重復(fù)性的結(jié)果，保證在整個實驗過程中染色質(zhì)一直處于冰上。盡量避免反復(fù)凍融，制備完成后獨立分裝到小管中保存，可以幫助防止染色質(zhì)的降解。在Chromatrap?提供的試劑盒中，每個IP所需要的染色質(zhì)是極小量的，因此每一個獨立分裝的小管樣品可以提供多次ChIP實驗所需的染色質(zhì)量。

正如上述提到的，染色質(zhì)的質(zhì)量在得到一個好的ChIP結(jié)果中起著關(guān)鍵性作用。為了保證較好的染色質(zhì)的質(zhì)量，細(xì)胞的交聯(lián)條件需要被不斷優(yōu)化。避免過度交聯(lián)細(xì)胞這一點尤為重要，因為這會導(dǎo)致細(xì)胞耐受后續(xù)的裂解和超聲片段化。過度交聯(lián)細(xì)胞也會影響反交聯(lián)的效率（即交聯(lián)效果不能被有效地去除），這會影響后續(xù)的實驗過程（例如qPCR）。

Chromatrap?推薦使用1%的甲醛于培養(yǎng)基或PBS中交聯(lián)細(xì)胞，在室溫條件下于旋轉(zhuǎn)混勻器上交聯(lián)10分鐘即可。如果效果依舊不佳，可嘗試將交聯(lián)時間減少至5分鐘。

交聯(lián)細(xì)胞這一過程會影響所制備的染色質(zhì)的質(zhì)量從而影響整個ChIP實驗。確保每次制備染色體的過程中使用的甲醛都是現(xiàn)配現(xiàn)用的，這也可以保證實驗結(jié)果具有更好的可重復(fù)性。確保甲醛中沒有甲醇的污染，因為甲醇可以破壞細(xì)胞膜從而改變交聯(lián)條件。

染色質(zhì)可以通過超聲處理（超聲波機(jī)械斷裂）或者酶解（微球菌核酸酶消化）的方式片段化。根據(jù)細(xì)胞的不同選擇合適的片段化方式是十分重要的。Chromatrap?可以依據(jù)片段化方法的不同提供相應(yīng)的試劑盒。我們也可以提供酶解片段化的優(yōu)化試劑盒。

在無法使用超聲處理或者為了盡可能減少對可被特異抗體識別的蛋白抗原表位的破壞的情況下，酶解片段化方法十分有效。然而，這種方法具有一定的偏好性，因為核酸酶具有切割特定基因序列的特性。酶解片段化主要應(yīng)用于非交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（Native ChIP）實驗，在這個過程中，染色質(zhì)與蛋白質(zhì)并沒有被交聯(lián)，這時如果采用超聲處理來片段化染色質(zhì)將破壞染色質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用形成的復(fù)合物。一些細(xì)胞種類也許耐受裂解從而導(dǎo)致較差的酶解片段化效率，在這種情況下可以嘗試超聲處理來同時幫助細(xì)胞的裂解以及染色質(zhì)的片段化。

以下列出了超聲處理以及酶解片段化的優(yōu)缺點，供您優(yōu)化片段化過程中參考從而提高效率。